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背景：

線粒體膜通透性轉換孔（mitochondrial permeablity transition pore，MPTP），又稱線粒體巨型通道（magachannel），是存在于線粒體內外膜之間的非選擇性高導電性通道，由多種蛋白質復合組成。線粒體通透性轉換孔（mPTP）可能參與了細胞死亡過程中線粒體成分的釋放。正常的細胞線粒體內膜可維持正常的線粒體電位梯度以保證細胞呼吸作用及能量供應，隨著Ca2+的攝入和釋放，一種低電導滲透性轉換孔在張開和閉合中來回切換。當細胞發(fā)生凋亡時和病理性死亡時，線粒體膜電位轉換孔滲透性發(fā)生改變，Ca2+的過載，線粒體的氧化，活性氧水平的升高，包括后繼的釋放，線粒體膜電位下降等都會導致線粒體滲透性轉換孔的激活。

標記：

1.將細胞培養(yǎng)基與EdU溶液按照500：1的比例混合，制成2×EdU標記培養(yǎng)基。

2.提前將2×EdU標記培養(yǎng)基預熱，然后將150微升2×EdU標記培養(yǎng)基與等體積細胞培養(yǎng)基混合，獲得1×EdU溶液。

【注】：①不建議替換全部培養(yǎng)基，這樣可能會影響細胞增殖的速度。②配置好的培養(yǎng)基建議現用現配，用量以沒過細胞為宜。

3.孵育細胞2 h，棄培養(yǎng)基。

【注】：①培養(yǎng)時間取決于細胞的增殖速度和生長狀態(tài)。②大多數腫瘤細胞以及粘附細胞系均可采用2 h的孵育時間。

4.以1xPBS清洗細胞兩次，每次5 min, 以除去未摻入DNA的EdU殘留。

【注】：對于貼壁不牢的細胞可降低清洗強度。

實驗步驟：

1. 將細胞以 104-105 個細胞/孔的密度接種在 96 孔板 中，加入 100μL 培養(yǎng)基，含或不含待測化合物。在 CO2 培養(yǎng)箱中在 37℃ 下培養(yǎng)細胞 24 小時。

2. 向板中加入 10μL 不同濃度的待測物質。

3. 在培養(yǎng)箱中將培養(yǎng)板培養(yǎng)適當時間（如 6、12、24 或 48 小時）。

4. 向板的每個孔中加入 10μL CCK-8 溶液。小心不要將氣泡引入孔中。

5. 將平板在培養(yǎng)箱中孵育 1-4 小時。

6. 在讀板之前，在定軌振蕩器上輕輕混勻。

7. 使用酶標儀測量 450nm 處的吸光度。

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